生物工程技術在生物凈化上的應用
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【摘要】目的：探究在大小鼠生物凈化中應用生物工程技術的效果。方法：自2016年1月開始，本研究中心選擇常用的C57BL/6J品系小鼠作為研究A組、選擇SD大鼠作為研究B組，在繁殖中應用生物工程技術；另選擇一部分小鼠與大鼠作為對照A、B組，在其繁殖過程中不做任何干涉隨機。每組研究對象15只。實驗開始前，對所有鼠的病原微生物進行檢測。應用體外受精與胚胎移植的生物工程技術，在HTF培養液中完成受精并發育至2-細胞時期，將胚胎移植入購買來并激素處理過的代孕SPF級ICR雌鼠的輸卵管中。代孕ICR雌鼠生下子代，子代3周離乳后，對代孕ICR雌鼠和隨機挑選的子代一只進行檢測。統計研究A、B組的采集卵子數、2-細胞數與移植胚胎數。統計四組研究對象的平均每胎產仔數、存活率。統計凈化前后四組研究對象的病原微生物檢出率及凈化率。結果：研究A、B組生物工程技術指標（采集卵子數、2-細胞數與移植胚胎數）比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；四組研究對象平均每胎產仔數與存活率比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；四組研究對象在合籠與體外受精前，均尾靜脈取血進行血霉菌培養。仔鼠出生3周離乳后，每胎隨機選一只與其代孕ICR母鼠一起進行尾靜脈取血，進行血霉菌培養，對照A、B組的凈化率均顯著低于研究A、B組（P<0.05）。結論：在小鼠大鼠的生物凈化中應用體外受精與胚胎移植的生物工程技術，在不影響代孕母鼠的生殖能力與子代存活率的情況下，顯著地提升了凈化率，達到了研究的目的，從而能為臨床動物實驗提供更多優質可用的實驗動物。
【關鍵詞】體外受精；胚胎移植；C57BL/6J小鼠；SD大鼠；病原微生物
1材料與方法
1.1材料
自2016年1月開始，本研究中心選擇常用的C57BL/6J品系小鼠作為研究A組、選擇SD大鼠作為研究B組，在繁殖中應用生物工程技術；另選擇一部分小鼠與大鼠作為對照A、B組，在其繁殖過程中不做任何干涉隨機。每組研究對象15只。納入標準；所選小鼠與大鼠均為8周大；取血樣進行培養，結果出現了下面五種病原菌的任意一種：金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌、肺炎鏈球菌。排除標準：接種了同種或異種動物的腫瘤組織。
1.2方法
1.2.1體外受精
1.2.1.1應用頸椎脫臼法處死雄性C57BL/6J小鼠與SD大鼠，剖開腹腔，將兩側的睪丸與附睪取出，置于含HTF培養液的EP管中，在超凈工作臺中分離出附睪，將組織與血塊剔除后，將附睪放置于預先經過平衡處理的HTF獲能液中處理2h，以完成獲能[5]。1.2.1.2體外受精前3d，對雌性C57BL/6J小鼠與SD大鼠進行注射PMSG的處理（7.5IU）。在48h后，繼續對供卵的雌性注射7.5IU的hCG。14h后，經過兩種激素處理過的雌鼠，頸椎脫臼處死，剖開腹腔后將雙側輸卵管分離出來，置于預先經過平衡處理的HTF培養液[6]，分離出卵團。1.2.1.3選擇活力旺盛的精子，將其轉移進入培養卵的培養液中，置于CO2培養箱中培養6h，完成受精后洗滌受精卵。次日，選擇發育到2-細胞階段的胚胎進行移植。
1.2.2胚胎移植[7]
1.2.2.1在實驗開始前兩周，對成熟的SPF級ICR雄鼠進行結扎。將雄鼠用3%水合氯醛麻醉后，從睪丸處剪開皮膚，找到輸精管，取一段約3mm長的組織，以保證輸精管完全斷開。待結扎雄鼠恢復一周后，進行試懷孕，以確定將殘存在輸精管中的精子排除干凈，方可進行接下來的假孕操作。1.2.2.2將成熟的SPF級ICR雌鼠與結扎雄鼠以2︰1的比例進行合籠，次日上午8：00~9：00檢栓，見栓的雌鼠可以用來做胚胎移植的代孕母鼠[8]。1.2.2.3代孕母鼠用水合氯醛麻醉后，用酒精消毒后置于解剖鏡下，小鼠采取俯臥位，在肋骨下緣出剔除毛發，剪開一個約5mm的切口，找到脂肪墊后將卵巢與子宮一并牽引出體外[9]。固定后，在解剖鏡下確定輸卵管傘部的位置。用自制的移卵吸管吸取滿足移植要求的2-細胞胚胎，從輸卵管傘部的切口出將胚胎吹入。關腹。將代孕的ICR雌鼠放置在SPF級鼠房[10]，等待其生產。
1.2.3新生仔鼠21d離乳后，與其代孕母鼠，一同進行尾靜脈取血，涂抹在培養基上進行培養。培養1周后，與細菌標準品進行對比，以確定是否發生病原微生物的感染[11]。
1.3觀察指標
統計研究A、B組的采集卵子數、2-細胞數與移植胚胎數。統計四組研究對象的平均每胎產仔數、存活率。代孕ICR雌鼠生下子代，子代3周離乳后，對代孕ICR雌鼠和隨機挑選的子代一只進行檢測，統計凈化前后四組研究對象的病原微生物檢出率及凈化率。
1.4統計學處理
采用SPSS18.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x-±s）表示，多組間比較采用方差分析，比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較采用X2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。
2結果
2.1研究A、B組的采集卵子數、2-細胞數與移植胚胎數的對比研究A、B組生物工程技術指標（采集卵子數、2-細胞數與移植胚胎數）比較，差異均無統計學意義（P>0.05）.
2.2四組研究對象平均每胎產仔數、存活率對比對四組研究對象的平均每胎產仔數與存活率進行分析，四組比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
2.3凈化前后四組研究對象的病原微生物檢出率及凈化率四組研究對象在合籠與體外受精前，均尾靜脈取血進行血霉菌培養。仔鼠出生3周離乳后，每胎隨機選一只與其代孕ICR母鼠一起進行尾靜脈取血，進行血霉菌培養即性成熟后，對照組的凈化率顯著低于研究組（P<0.05）。
3討論
20世紀50~60年代，體外受精（invitrofertilization，IVF）與胚胎移植（embryotransfer，ET）開始起步[12]，經過近半個世紀的發展與進步，在小鼠與大鼠中運用這兩種技術已經非常成熟并得以廣泛應用，在基因敲除動物模型的構建、生物凈化、克隆動物的建立中具有相當重要的作用[13]。在動物實驗中，最常用的就是SPF級動物，這種動物不僅能排除病原微生物對實驗與結果的影響，還可以減少對一起飼養的同類與實驗人員健康的不利影響[14]。SPF級動物憑借其對飼養條件要求不高的特點受到了諸多研究人員的青睞，其中C57BL/6J小鼠與SD大鼠是動物實驗中常用的兩種實驗動物。通常在他處動物中心購買的小鼠大鼠，原實驗室能夠保證動物處于SPF級。由于多種原因，如從動物中心購買后的運輸過程、實驗室本身的安全級別較低，有可能會使應該是無特定病原體級的小鼠與大鼠感染微生物，無法達到無特定病原體級的實驗要求。在過去的時候，對小鼠大鼠進行生物凈化，常用的是藥物處理，但這種方式的凈化率較為低下且成本高[15]。隨著生物工程技術的不斷發展，有研究表明，胎盤的屏障作用能夠防止病原微生物從母體側進入胎兒的體內。研究人員利用此原理，大力發展體外受精與胚胎移植技術在生物凈化中的應用[14]。為此，本院選擇部分病原微生物檢測不合格的C57BL/6J小鼠與SD大鼠，體外受精后將胚胎移植進入代孕的SPF級ICR雌鼠內，以探究生物工程技術在生物凈化中的應用。本研究中，將被微生物污染的雄性C57BL/6J小鼠與SD大鼠在實驗室外處死后，取出儲存成熟精子的附睪，在超凈工作臺中分離出精子，在HTF培養液中使精子獲能[16]。對雄性進行操作的同時，對同樣被污染的雌性C57BL/6J小鼠與SD大鼠，注射PMSG與hCG進行超數排卵的操作，選擇形態與功能良好的卵團與運動活躍的精子一同培養完成體外受精的操作。本研究中，應用確定為SPF級ICR結扎雄鼠，與可孕的ICR雌鼠合籠誘導假孕，為接納體外發育至2-細胞時期的胚胎做好準備[17]。 目前，應用胚胎移植技術進行生物凈化有兩種策略，第一種是雌鼠與雄鼠自然合籠交配，從雌鼠的子宮角中分離受精卵，然后移植到代孕雌鼠體內。這種操作需要研究人員從一側子宮角注射生理鹽水將胚胎沖出，所獲得的胚胎數目較少，而且需要大量的雌鼠與雄鼠合籠，成本比較高[18]。為了提高凈化率的同時盡可能地降低成本，研究人員開發出了生物凈化的第二種方法——超數排卵、體外受精與胚胎移植。這種操作方法只需要處死一只雄鼠，大大節省了實驗動物的用量，使得凈化的速度得以加快，種群得以快速繁殖[19]。 本研究結果顯示，研究A、B組的生物工程技術指標（采集卵子數、2-細胞數與移植胚胎數）比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；四組研究對象平均每胎產仔數與存活率比較，差異均無統計學意義（P>0.05），這兩個數據說明了生物工程技術對代孕母鼠的生育能力未產生影響，對子代的生存率與質量未產生影響；四組研究對象在合籠與體外受精前，均尾靜脈取血進行血霉菌培養。仔鼠出生3周離乳后，每胎隨機選一只與其代孕ICR母鼠一起進行尾靜脈取血，進行血霉菌培養，對照A、B組的凈化率均顯著低于研究A、B組（P<0.05）。 綜上所述，在大小鼠的生物凈化中應用體外受精與胚胎移植的生物工程技術，在不影響代孕母鼠的生殖能力與子代存活率的情況下，顯著地提升了凈化率，達到了研究的目的，從而能為臨床動物實驗提供更多優質可用的實驗動物，在實際的研究工作中有較大的應用價值。
作者：劉勇 史嘉翊 劉潔婷 柏合 單位：牡丹江醫學院
